淄博铁皮保温施工队 雄全异株流苏树的花部特征及繁育系统研究

自然界中, 植物的系统在个体和居群水平有雌雄同株、雌雄异株、雄全同株、雌全同株、雄全异株等多种形式[1]。其中, 雄全异株为罕见。形态的雄全异株其繁育本质是雌雄异株[2-5], 仅有少数物种被证实是功能的雄全异株[6-11]。

流苏树(Chionanthus retusus Lindl. et Paxt), 是木犀科(Oleaceae)流苏树属植物, 主要分布在中国, 日本和朝鲜半岛有少量分布[12]。其有绿化、观赏、入药和制茶等多种价值。随着生境的退化和片断化, 野生资源毁坏严重。流苏树在日本被列为红皮书保护物种[13], 在中国也被报道面临生存危机[14]。目前, 关于流苏树的研究主要侧重栽培应用[15]和药用成分[16-18]等方面, 且文献对于流苏树花别的描述各异：花单而雌雄异株或两花[12]、亚雌雄异株[19]、雌雄异株[20]、雄全异株[21-22]等。本研究前期调查显示, 流苏树形态上是雄全异株。其传粉生物学方面的研究尚未见报道, 它究竟是形态的还是功能的雄全异株亦不明确。本文就其开花动态、花部结构、传粉媒介和繁育系统等方面展开研究, 揭示流苏树的传粉机制, 探讨其雄全异株的维持策略及演化途径。

1 材料与方法 1.1 研究材料和地点

本实验选取4个流苏树居群, 分别位于鸡公山保护区、桐柏淮源风景区、郑州绿博园、河南大学校园。其中, 前两者为野生居群, 后两个是人工引种。各居群的地理位置、气候特征等见表 1。

1.2 研究方法 1.2.1 开花动态与花的形态结构观察

2014—2016连续3 a对河南大学校园的流苏树跟踪观察, 记录其开花动态。盛花期时从各个居群中选雄株和两株各3, 每株随机选10朵完全盛开的花, 用游标卡尺分别测量花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊等各部分的尺寸。

本研究将流苏树的开花进程分为5个时期。花蕾期：花序随叶片展开至花瓣即将展开阶段。将花期：花瓣的螺旋式折叠松开, 颜变浅。始花期：70%的花处于将花期, 10%的花盛开。盛花期：70%的花盛开, 花药开始散粉。末花期：几乎所有的花完全盛开, 90%花药开裂, 部分花瓣开始萎蔫、变黄或脱落。

从花芽萌动开始, 每天分别取雄株和两株的花芽(序), 用FAA液固定, 4℃保存。采用常规石蜡切片法制片, 铁矾-苏木精染。要时进行体视显微镜或扫描电镜拍照。

1.2.2 繁育系统

(1) 花粉活力、柱头可授、花粉量和胚珠比(P/O值)和杂交指数(OCI)测定

从花蕾期开始, 每天中午取10朵两花, 用联苯胺-过氧化氢反应液[联苯胺:过氧化氢:水=4:11:22 (体积比)]检测柱头的可授。同时, 采用离体培养的方法分别检测两花和雄花花粉在各个时期的活力。

每居群分别选取盛开但花药未开裂的两种花各30朵用FAA固定, 经NaOH软化和KCl定容, 统计单花花粉量, 另取30朵两花在解剖镜下统计胚珠数, 计算P/O值。杂交指数(OCI)参照Dafni [23]的方法。

地址：大城县广安工业区

(2) 传粉媒介

盛花期时, 分别从各个居群选6株花量较多的植株(雄、两各3), 连续2 d对造访昆虫的访花时间和访花行为进行观察和拍照, 捕捉造访昆虫制成标本后带回请家鉴定。

以重力玻片法检测花粉在空气中的散布。从郑州绿博园选取4棵相对孤立的单株, 盛花期时, 以树干为中心, 从东南西北4个方向, 距树干1、2、4、8、16 m的地方放置涂布凡士林的载玻片。24 h后回收并统计流苏树花粉粒。

(3) 交配方式

在4个居群中选择长势良好的两株, 进行如下几种处理: (1)不去雄、不套袋, 开放式传粉, 挂牌标记为对照；(2)不去雄, 套袋, 检测自发自花授粉率；(3)去雄, 人工授同株异花花粉后套袋, 检测是否自交亲和；(4)去雄, 人工授异株两花花粉后套袋, 检测两花花粉受精率；(5)去雄, 人工授雄花花粉后套袋, 检测雄花花粉的受精率；(6)不去雄, 套100目的纱网(孔径150 μm, 限制昆虫进入, 花粉能随风穿过), 检测风传粉率；(7)去雄, 不套袋、不套网、不授粉, 检测是否受花粉限制；(8)去雄、不授粉套袋, 检测是否存在无融生殖现象。每个处理每个居群分别做20—30个花序, 每个花序仅保留30以内的小花数。处理后10 min, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 32 h时分别固定若干雌蕊(卡诺液), 8 mol/L NaOH软化, 0.1%脱苯胺蓝溶液染, 甘油封片, 在荧光显微镜下观察花粉粒萌发及花粉管的生长情况。授粉一个月后统计各花序的结实率。花序结实率(%)=果实数/处理的花数×100%。

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1.2.3 数据分析

利用SPSS 19.0软件对花的形态特征数据进行两因素方差分析, 结实率数据进行反正弦转换后采用Duncan法进行多重比较, P < 0.05表示差异显著, 用Excel进行作图。

2 结果 2.1 流苏树的开花动态及花部特征

流苏树花萼4裂, 披针形。花冠白, 花冠管长约3 mm, 花瓣裂片4, 长条形(图 1)。剖开花冠管, 雄花内部含2枚雄蕊(图 1), 两花有2枚雄蕊和1枚雌蕊(图 1)。观察发现, 河南大学校园流苏树于前1年12月至当年3月进行花芽分化, 3月下旬花叶展开。受天气影响, 每年的花期有变动。2014年3月27日, 花蕾与叶展开, 4月4日进入将花期, 5日始花期, 6—12日盛花期, 期间8—10日小雨。2015年4月1日花蕾露出幼叶, 随后持续多云小雨；15日进入将花期, 16日始花期, 连续3 d小雨；20—23日盛花期。2016年4月1日花蕾外现, 8日将花期, 10日始花期, 12 —14日盛花期。

对4个居群中处于盛花期的雄花与两花11个特征进行比较分析发现, 小花直径、花瓣长、花瓣宽、萼片长、萼片宽、花药长和花药宽等特征在居群之间有显著差异, 总体来看, 鸡公山和桐柏两个野生居群在多个花部特征上明显数值偏低。在同一居群内部, 小花直径、花冠管长和单花花粉存在显著的别差异, 雄株的单花花粉量要显著多于雌株, 其他特征在雄花与两花之间没有显著差异(表 2和表 3)。

2.2 花的解剖学观察

通过扫描电镜和石蜡切片观察, 流苏树雄花与两花的花芽分化初期至雄蕊分化期的发育过程基本一致(图 2)。两种花的雄蕊均正常发育, 花药开裂后, 产生二细胞花粉粒(图 2)。电镜下可见雄花和两花的花粉粒都是椭圆形, 具3个萌发沟, 表面为网状纹饰(图 2, 两花粉粒图片未提供)。

在雌蕊分化的过程中, 两花的花药基部内侧生长点逐渐产生两个心皮原基, 随后愈并分化形成具两室的子房, 中轴胎座, 顶部伸长形成花柱和柱头, 终发育成完整具功能的雌蕊(图 2)。雄花中也有心皮原基的产生, 其愈后于中央形成一个空室并停止发育, 后整体退化(图 2)。

2.3 繁育系统 2.3.1 花粉活力、柱头可授、花粉胚珠比(P/O)与杂交指数(OCI)测定

流苏树雄花和两花的花粉于花药自然开裂后, 均能在培养基(10%蔗糖+0.015%硼酸+2%琼脂)上萌发(图 1)。散粉两天内萌发率较高(＞80%), 随后逐渐减弱, 室温放置2周左右, 萌发率降到10%以下, 视为活力丧失(图 3)。经过方差分析, 花粉萌发率在别间没有差异(P=0.277)。苯胺蓝染和扫描电镜均能观察到柱头上的花粉管(图 1), 雄花与两花的花粉粒授粉1 h后开始萌发, 伸长的花粉管从乳头细胞间隙进入花柱, 16 h后花粉管到达胚珠, 说明雄花与两花的花粉都具有雄功能。联苯胺溶液显示两花的柱头在将花期有一定的可授, 而此时花粉无活, 说明其为雌蕊先熟。图 3和表 4显示出流苏树同一朵花的雌雄配子体可遇期为3—5 d。流苏树两花单花的平均花粉量40000—60000, 胚珠数固定为4, 则两花P/O值是10000—15000；杂交指数OCI为3。

2.3.2 传粉媒介

通过重力玻片法检测到空气中有流苏树花粉散布(图 1)。从图 4可以看出, 风能把大量流苏树的花粉传播到16 m以外的地方。盛花期时, 在晴朗的天气, 很少有昆虫长时间地访问流苏树的花, 偶有双翅目的食蚜蝇(Syrphidae)(图 1)会触碰花朵, 停留时间仅几秒。同时, 发现有蓟马(Thripidae)在花冠管内部长时间活动, 而且, 体视镜下可见蓟马全身布满流苏树的花粉(图 1)。食蚜蝇和蓟马可能是该树主要的传粉昆虫。在控制授粉实验结果中, 自然套网与对照及自发自交的结实率均有显著差异, 说明风与昆虫在其传粉过程均发挥了重要作用。

2.3.3 人工控制授粉

在人工控制授粉实验中, 两花去雄不授粉套袋后均不能结实, 表明流苏树不存在无融生殖现象。其他处理的结实率经方差分析, 各处理间有显著差异(F=374.808, P < 0.01)。图 5显示同株异花授粉与自发自交的结实率分别是36.94%和10.70%, 有显著差异, 说明其自交亲和, 传粉者对结实率有重要影响。雄株两株杂交和两异株杂交的结实率分别是41.11%和49.49%, 说明流苏树异交亲和, 且异交结实率要显著高于自交(同株异花)。对照的结实率(34.36%)显著高于自然套网(24.67%), 表明昆虫与风在流苏树的传粉过程中都发挥了重要作用。去雄不处理和自发自交的结实率低, 均显著低于对照；人工授粉的结实率均显著高于对照；显然, 在自然授粉的过程中, 流苏树受到花粉限制或者传粉者限制造成花粉不足。就4个居群分析, 桐柏的结实率显著低于其他3个居群(F=10.001, P < 0.01)。图 5显示桐柏居群自然套网和自然对照的结实率明显低于其他3个居群, 去雄不处理和自发自交两个处理中, 桐柏的结实率略低于其他居群但并没有显著差异；同时, 在3个人工授粉的处理中, 桐柏居群的结实率均高。可见, 桐柏居群结实率的降低受到传粉媒介的影响。

3 讨论 3.1 流苏树的系统和传粉机制

通过对多个流苏树居群的调查, 发现只存在雄株和两株, 没有文献中提到的“花单而雌雄异株”的雌株, 未发现雌花, 亦未发现雄花与两花同株现象。本调查结果与Soejima等[21]、马红[24]及Song等[22]的研究报道一致。结本文控制授粉结果, 流苏树的系统应描述为雄全异株。

诸多研究表明, 被子植物别表型受植株大小和年龄[25-27]、环境[28-29]及遗传等多种因素的影响[30]。作为反映表达特征的花部特征, 不仅受到遗传的控制, 同时会受到生境条件的影响[31]。本研究所调查的居群中均同时存在两株和雄株, 且每个个体的别在3 a中没有发生变化, 说明流苏树的表达系统具有相对稳定的遗传基础。流苏树花的萼片、花瓣与花药等特征在4个居群间有显著差异, 说明受环境的影响较大, 该发现Song等[22]对韩国4个居群的观察是一致的。但是, 本研究发现花部特征的别差异没有Song等[22]的结果明显。这种差异可能由实验材料的年龄、居群大小、生境等因素造成的, 后续研究应该增加跨区域的比较。

流苏树雄株和两株的花量和花粉量均较大, 萼片上具腺毛结构, 这是植物适应风媒和虫媒的特征[32-33]。从测定的P/O值看, 按照Cruden[34]标准, 流苏树应是异交。但OCI值显示流苏树的繁育系统却是自交亲和, 有时需要传粉者, 而这与人工授粉的实验结果一致。这一现象符Preston[35]的结论：P/O不是评判繁育系统的唯一指标。那么, 高的P/O值可能是对有传粉者收集花粉的过程中所造成大部分花粉损失的补偿[36]。雄花与两花中均未观察到蜜腺结构, 与Song等[22]的报道一致。没有蜜汁为传粉动物提供报酬, 因而, 在花期内未吸引到大量的传粉昆虫。蓟马繁殖能力强, 可随风力飞行, 其隐匿于花中吸食花粉, 食蚜蝇捕食蓟马, 它们的行为完成被动传粉。人工授粉实验中, 桐柏居群自然传粉的3个处理(对照、套网和去雄不处理)的结实率显著低于其他居群, 但人工传粉处理的结实率在地区间没有差异。显然, 自然界的传粉媒介在桐柏居群受到影响。本实验在桐柏居群具体的实施地点位于一个山凹的石崖下, 刚好是一个“避风港”, 鸡公山的实验点在紧邻高峰的次峰上, 基本是一个风口, 另两个栽培地都是平原地带, 均不避风。可见, 风在流苏树的传粉过程中起着重要的作用。空气中有花粉散布, 两花经套网后结实率比套袋结实率高, 比对照的结实率低, 且差异显著, 说明流苏树为风媒和虫媒混传粉类型。

流苏树雄花与两花花粉的形态结构、离体萌发率均无差异, 人工授粉均能结实说明雄株与两株都具有雄功能, 是典型的功能雄全异株。流苏树自交与异交都亲和, 而且异交的结实率显著高于自交。一方面, 异交有利于子代产生新的遗传变异, 增加物种的遗传多样, 避免自交衰退, 更有利于物种的延续；另一方面, 流苏树的雌蕊与雄蕊的外部有花冠管的包被, 直接接受外来花粉的概率很小, 同时花期多雨, 传粉者种类单一且活动易受到气温与风速等天气状况的影响, 自交亲和在缺少有传粉者时为其提供一定的生殖保障[37]。当然, 流苏树自身的生存策略是杂交还是自交占优势, 尚需要“父本分析”数据才能进一步说明, 这部分实验是我们下一步正进行的工作。

3.2 流苏树雄全异株的维持与演化

作为一种罕见的繁育系统, 雄全异株植物在进化过程中要得以维持, 须是完全杂交或自交率很低, 且伴随着很强的自交衰退[38-39]。理论上要求雄全异株群体中雄株的适度比两株在授粉上存在2倍以上的优势[40-41]。就我们研究的居群来看, 流苏树雄株在不同群体中的比例变化较大(39.5%—57.6%), 并不符雄全异株群体中雄株比例低于0.5的理论要求, 这一现象在木犀科其他的雄全异株物种中同样存在[42-43]。另外, 流苏树野生资源破坏非常严重, 尤其在种子价格炒至50—150元/kg的情况下, “伐木取种”严重破坏了别比例。同时我们调查的都是成年流苏树, 在人为干扰的情况下, 这个数据可能并不能完全反映流苏树自然群体的状况。但是, 就单花花粉量来看, 流苏树雄株凸显出大的资源优势。

雄全异株与雌雄异株的演化关系已经成为目前研究的焦点[41]。传统观点认为, 雌雄异株种群中的雌株突变获得微弱的雄功能, 这种突变体进而得到保留, 即雄全异株起源于雌雄异株[44]。另一种观点认为, 雌雄同株(雌雄同花或雌雄同株)种群中产生了雌不育突变体并得以保留, 即雄全异株来源于两个体。木犀科植物的雄全异株现象已报道多例, 并从不同的角度为二种观点提供证据[45-46]。分子系统学证实白蜡树雄全异株群体是由两株向雌雄异株的过渡状态, 而且其传粉媒介由虫媒向风媒传粉进化[47]。本研究比较了流苏树雄株和两株花芽分化过程, 两花的雌蕊发育正常, 而雄花的雌蕊在发育早期有心皮原基的产生, 随后愈形成一个空腔并终退化。显然, 流苏树的雄花存在雌蕊退化的痕迹。同时, 本研究结果表明, 流苏树是由昆虫和风共同传粉, 结Wallander[47]的结论, 流苏树的雄全异株同样也是由两株群体向雌雄异株群体进化的过渡类型。